اين بار در اواسط سال 916 بصوب خراسان عزيمت كرد و پس از تسخير مشهد بتعقيب ازبكان كه بمرو پناه جسته بودند رفت . شاه اسماعيل در 26 شعبان 916 بر قلعهء مرو حمله برد و در نتيجه جنگى سخت كه در آن قريب 10000 ازبك بقتل رسيدند فتحى نمايان كرد و شيبك خان در معركه جان سپرد .
فتح مرو از وقايع مهمّ آسياى مركزى است چه از اين تاريخ ببعد فتنهء بزرگى كه از جانب تركان بار ديگر ايران و هندوستان را تهديد ميكرد از ميان برخاست و مذهب شيعه كه هنوز در ايران جانى نگرفته بود و شيبك خان در محو آن بجان ميكوشيد از خطرى بزرگ رهائى يافت و شاه اسماعيل و ظهير الدّين بابر كه او نيز در همين اوان دولتى بزرگ در هند تأسيس كرده بود هر دو از شرّ خصمى قوى نجات يافتند و همين مسئله از اين تاريخ ببعد بين سلاطين صفوى ايران و پادشاهان گوركانى هند ايجاد دوستى و الفت پايدارى كرد و شاه اسماعيل براى تحكيم مبانى دوستى خواهر بابر را كه بچنگ ازبكان اسير افتاده و در نتيجهء فتح مرو رها شده بود باحترام تمام پيش برادر بهند فرستاد .
بعد از اين فتح بزرگ شاه اسماعيل بهرات رفت و چون زمستان را در آنجا بخوشى گذراند به خيال تسخير ماوراء النّهر تهيهء سپاه ديده در بهار 917 عنان عزيمت بدان صوب متوجه ساخت و تا حدود جيحون پيش رفت ولى از آنجا تجاوز ننمود و بآذربايجان برگشت .
لشكركشى بماوراء النّهر در 918
در نتيجهء دوستى كه ميان ظهير الدّين بابر و شاه اسماعيل برقرار شده بود طرفين قرار گذاشتند كه به يارى يكديگر بماوراء النهر لشكر ببرند و ريشهء تسلط ازبكان را بكلّى از آن ديار قلع كنند . شاه اسمعيل امير الامراى خود را كه امير يار احمد اصفهانى نام و نجم ثانى لقب داشت با لشكرى به آنجا فرستاد و بابر نيز بكمك آمد ليكن پس از گذشتن از جيحون و بخارا از جانشين شيبك خان شكست خوردند و نجم ثانى بقتل رسيد و از اين لشكركشى شاه اسمعيل و بابر جز هزيمت نتيجهاى نبردند .